kandungan bersembunyi
1 JURUSAN SEMESTA TELL-Seq Pengayaan Sasaran
2 Arahan Penggunaan Produk
3 pengenalan
4 Kandungan Kit
5 Bahan Habis dan Peralatan (tidak disediakan)
6 Aliran Kerja Tangkapan Exome Manusia TELL-Seq™
7 Protokol
8 Persediaan
9 Basuh Manik
10 AmpPerpustakaan lify
11 Bersihkan Perpustakaan
12 Layakkan dan Kirakan Perpustakaan untuk Pengayaan Sasaran
13 Hibrid Perpustakaan TELL-Seq™ kepada Panel Tangkapan Exome
14 Sediakan Manik Magnet bersalut Streptavidin
15 Tangkap DNA Hibrid menggunakan Manik bersalut Streptavidin
16 AmpPerpustakaan Ditangkap lify
17 Layakkan dan Kirakan Perpustakaan yang Ditangkap untuk Penjujukan
18 Dokumen / Sumber
18.1 Rujukan
19 Catatan Berkaitan

UNIVERSAL-SEQUENCING-LOGO

JURUSAN SEMESTA TELL-Seq Pengayaan Sasaran

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-image-produk

Spesifikasi:

  • Nama Produk: Pengayaan Sasaran TELL-SeqTM
  • Untuk: Penggunaan Penyelidikan Sahaja, bukan untuk prosedur diagnostik
  • Pengilang: Universal Sequencing Technology Corporation
  • DNA Genomik yang Diperlukan: 5ng
  • Keadaan Penyimpanan: Penampan Tris pH 7.5-8.0 atau penimbal TE rendah

Arahan Penggunaan Produk

Cadangan Input DNA Genomik:
Pastikan anda mempunyai sekurang-kurangnya 5ng DNA genomik untuk protokol. DNA berat molekul tinggi adalah penting untuk penjujukan yang berjaya. Kuantiti DNA menggunakan kaedah berasaskan fluorometri seperti Qubit dsDNA BR Assay Kit atau HS Kit. Cairkan DNA pekat kepada kepekatan kerja (0.4ng/l hingga 1ng/l) dalam penimbal Tris sebelum pengukuran. Simpan DNA genomik dalam penimbal Tris dengan pH 7.5-8.0 atau penimbal TE rendah.

Kandungan Kit:

Kit Persediaan Perpustakaan TELL-SeqTM, Saiz Standard terdiri daripada dua kotak:

  • Kotak 1: Mengandungi pelbagai reagen termasuk Barcoding Enzyme, Exonuclease dan banyak lagi.
  • Kotak 2: Mengandungi TELL Bead Plexb, Wash Solution dan Stop Solution.

Nota: Jangan membekukan dan mencairkan reagen Kotak 1 lebih daripada 6 kali.

Soalan Lazim:

  1. S: Bolehkah saya menggunakan kaedah selain daripada yang berasaskan fluorometrik untuk mengukur DNA?
    J: Adalah disyorkan untuk menggunakan kaedah berasaskan fluorometri seperti Kit Ujian Qubit dsDNA BR atau Kit HS untuk pengukuran yang tepat. Elakkan kaedah yang hanya mengukur jumlah kepekatan asid nukleik.
  2. S: Bagaimanakah saya harus menyimpan DNA genomik untuk hasil yang optimum?
    A: DNA genomik harus disimpan dalam penimbal Tris dengan pH antara 7.5 – 8.0 atau penimbal TE rendah (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) untuk hasil terbaik.

Untuk Kegunaan Penyelidikan Sahaja. Bukan untuk digunakan dalam prosedur diagnostik.
Dokumen # 100032-USG v4.0
Ogos 2024
Dokumen ini adalah hak milik Universal Sequencing Technology Corporation dan bertujuan semata-mata untuk kegunaan pelanggannya berkaitan dengan penggunaan produk yang diterangkan di sini dan bukan untuk tujuan lain. Arahan dalam dokumen ini mesti diikuti dengan tepat oleh kakitangan yang terlatih dengan betul untuk memastikan penggunaan kit TELL-Seq™ yang betul dan selamat.
PERBADANAN TEKNOLOGI PENJURUSAN UNIVERSAL TIDAK MEMANGGU SEBARANG LIABILITI YANG BERLAKU SELEPAS PENGGUNAAN KIT TELL-SEQ™ YANG SALAH.
©2023 Universal Sequencing Technology Corporation. Semua hak terpelihara. TELL-Seq™ ialah tanda dagangan Universal Sequencing Technology Corporation. Semua nama, logo dan tanda dagangan lain adalah hak milik pemilik masing-masing.

Sejarah Semakan

Dokumen #100032-USG v1.0 November 2021 Keluaran Awal
Dokumen #100032-USG v2.0 Ogos 2022 Kemas kini protokol untuk berfungsi dengan kit Persediaan Perpustakaan TELL- Seq™ yang dikemas kini V1 dengan pilihan Penampan Suspensi EZ dan TELL Bead Plex
Dokumen # 100032-USG v3.0 Ogos 2023 Pilihan Manik TELL telah dikeluarkan. Hanya TELL Bead Plex digunakan untuk bergerak ke hadapan. Menambahkan Nota dan gambar dengan sistem pencampuran yang disyorkan untuk langkah kritikal putaran tiub yang betul semasa proses pengekodan bar untuk mengekalkan sifat DNA berat molekul tinggi.
Dokumen # 100032-USG v4.0 Ogos 2024 Panduan pengguna diubah untuk Pengayaan Sasaran umum. Menambahkan maklumat tambahan tentang menggunakan TELL-Seq™ Library Prep dengan sistem Pengayaan Sasaran yang lain

pengenalan

Protokol ini menerangkan cara menyediakan perpustakaan TELL-Seq™ berpasangan terindeks yang diperkaya dengan tangkapan hibridisasi menggunakan gabungan Kit Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™ dan Sistem Pengayaan Sasaran Agilent® SureSelect. Sistem Kit Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™ juga serasi dengan sistem Pengayaan Sasaran lain seperti IDT dan Twist Biosciences.
Kit persediaan perpustakaan TELL-Seq™ menggunakan teknologi Transposase Enzyme Linked Long-read Sequencing (TELL-Seq™) yang inovatif† untuk menyediakan perpustakaan berpasangan untuk menjana bacaan terpaut kod bar daripada sistem penjujukan Illumina®. Sistem Pengayaan Sasaran Agilent® SureSelect membenarkan pengayaan kawasan sasaran menggunakan probe tangkapan yang sangat spesifik. Setiap Sistem Pengayaan Sasaran mempunyai panel probe unik yang membolehkan kawasan tertentu ditangkap yang serasi dengan perpustakaan TELL-Seq™.

Cadangan Input DNA Genomik
DNA Genomik 5ng diperlukan untuk protokol ini. DNA berat molekul tinggi (HMW) adalah penting untuk penjujukan TELL-Seq™ yang berjaya.

  • Untuk genom manusia, minimum sampSaiz DNA hendaklah lebih besar daripada 40Kb.
  •  HMW DNA ranging from 100Kb to 300Kb are optimal material for best human phasing application.
  • Elakkan memecahkan DNA HMW semasa pengendalian. Keluarkan DNA berat molekul rendah (dikenal pasti sebagai sapuan kurang daripada 10Kb pada gel) dalam sample jika mereka membentangkan sebahagian besar dalam DNA sample.

Gunakan kaedah berasaskan fluorometri untuk mengukur DNA input. Jika anda menggunakan Kit Ujian Qubit dsDNA BR atau Kit HS, gunakan sekurang-kurangnya 2 µL setiap DNAample untuk ukuran. Elakkan kaedah yang hanya mengukur jumlah kepekatan asid nukleik, seperti NanoDrop atau kaedah penyerapan UV yang lain. Untuk pengukuran tepat kepekatan DNA HMW, cairkan DNA pekat kepada kepekatan kerja (0.4ng/µl hingga 1ng/µl) dalam penimbal Tris (pH 7.5-8.0) beberapa jam hingga sehari sebelum pengukuran kepekatan dan penyediaan perpustakaan. DNA genomik harus disimpan dalam penimbal Tris dengan pH antara 7.5 – 8.0 atau penimbal TE rendah (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). Untuk menilai ketulenan DNA sampOleh itu, nisbah ukuran penyerapan pada 260 nm kepada penyerapan pada 280 nm boleh digunakan. Protokol ini dioptimumkan untuk DNA dengan nilai nisbah penyerapan 1.8–2.0. Jika terdapat RNA berlebihan dalam DNA sampOleh itu, ia harus dikeluarkan dengan rawatan RNase.

Kandungan Kit

Kit Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™, Saiz Standard (2 Kotak)

Kotak 1 daripada 2: Kotak Reagen Perpustakaan TELL-Seq™ 1 V1 (PN 100035)

NOTA: Jangan membekukan dan mencairkan reagen Kotak 1 lebih daripada 6 kali.

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(1)

a Untuk digunakan dengan 10× Primer II dalam Kit Primer Multipleks Perpustakaan TELL-Seq™ bersama-sama untuk perpustakaan amppemberitahuan.

Kotak 2 daripada 2: Reagen Perpustakaan TELL-Seq™ Kotak 2 V1 (PN 100036)

Nama Komponen Warna Tudung Jilid (mL) Suhu Penyimpanan
BERITAHU Bead Plexb UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(2)CAP Oren 76 2°C hingga 8°C
Penyelesaian Basuh UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3)CAP Putih 4500 2°C hingga 8°C
Hentikan Penyelesaianc UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4)CAP Semulajadi 960 2°C hingga 25°C

b TELL Bead Plex berfungsi dengan baik pada kedua-dua Sistem Penjujukan Illumina dan bukan Illumina.
c Sebelum digunakan, jika Stop Solution tidak jernih atau mempunyai mendakan putih, panaskan tiub pada suhu 37C. Vortex untuk melarutkan sebarang mendakan. Selepas penggunaan pertama, simpan Stop Solution yang digantung semula pada suhu bilik untuk kegunaan masa hadapan.

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(5)AWAS

 Saluran paip TELL-Read v1.1 atau ke atas diperlukan untuk menganalisis data penjujukan yang dijana daripada perpustakaan TELL-Seq™ yang disediakan dengan TELL Bead Plex.

Kit Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™, HT24 (2 Kotak)
Kotak 1 daripada 2: Reagen Perpustakaan TELL-Seq™ Kotak 1 V1, HT24 (PN 100037) 

NOTA: Jangan membekukan dan mencairkan reagen Kotak 1 lebih daripada 6 kali. UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(6)

a Untuk digunakan dengan 10× Primer II dalam Kit Primer Multipleks Perpustakaan TELL-Seq™ bersama-sama untuk perpustakaan amppemberitahuan.

Kotak 2 daripada 2: Reagen Perpustakaan TELL-Seq™ Kotak 2 V1, HT24 (PN 100038)

Nama Komponen Warna Tudung Kelantangan Suhu Penyimpanan
BERITAHU Bead Plexb UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(2) Jingga 456 mL 2°C hingga 8°C
Penyelesaian Basuh UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(7) Biru 28.5 mL 2°C hingga 8°C
Hentikan Penyelesaianc UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) putih 5.76 mL 2°C hingga 25°C

b TELL Bead Plex berfungsi dengan baik pada kedua-dua Sistem Penjujukan Illumina dan bukan Illumina.
c Sebelum digunakan, jika Stop Solution tidak jernih atau mempunyai mendakan putih, panaskan tiub pada 37 ºC. Vortex untuk melarutkan sebarang mendakan. Selepas penggunaan pertama, simpan Stop Solution yang digantung semula pada suhu bilik untuk kegunaan masa hadapan.

PETUA PRO: DUA Kit Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™, HT24 termasuk kedua-dua Kotak 1 dan Kotak 2 boleh berpasangan dengan mana-mana Kit Primer Berganda Perpustakaan TELL-Seq™.

AWAS 
Saluran paip TELL-Read v1.1 atau ke atas diperlukan untuk menganalisis data penjujukan yang dijana daripada perpustakaan TELL-Seq™ yang disediakan dengan TELL Bead Plex.

Kit Primer Pelbagai (1-8) Perpustakaan TELL-Seq™ (PN 100003)

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(9) UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(10)

PETUA PRO: Satu Kit Primer Multipleks Perpustakaan TELL-Seq™ (1-8) mengandungi primer yang mencukupi untuk digunakan dengan EMPAT Kit Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™ WGS.

Kit Primer Pelbagai (9-16) Perpustakaan TELL-Seq™ (PN 100009)

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(11)

PETUA PRO: SATU Kit Primer Multipleks Perpustakaan TELL-Seq™ (9-16) mengandungi primer yang mencukupi untuk digunakan dengan EMPAT Kit Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™ WGS, Saiz Standard.

Kit Primer Pelbagai (17-24) Perpustakaan TELL-Seq™ (PN 100010)

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(12)

PETUA PRO: SATU Kit Primer Multipleks Perpustakaan TELL-Seq™ (17-24) mengandungi primer yang mencukupi untuk digunakan dengan EMPAT Kit Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™ WGS, Saiz Standard.

Kit Primer Penjujukan TELL-Seq™ Illumina® (PN 100004)

Nama Komponen Warna Tudung penumpuan Jilid (mL) Suhu Penyimpanan
Baca 1 Primer UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(8) Hitam 100mM 50 -25°C hingga -15°C
Baca 2 Primer UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) putih 100mM 50 -25°C hingga -15°C
Primer Indeks 1 UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(13) merah 100mM 50 -25°C hingga -15°C
Primer Indeks 2 UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-24 kuning 100mM 50 -25°C hingga -15°C

Penyekat Sasaran TELL-Seq™ (PN 100019)

Nama Komponen Warna Tudung Jilid (mL) Suhu Penyimpanan
Penyekat Sasaran TELL-Seq™ CAP Putih 40 -25°C hingga -15°C

Bahan Habis dan Peralatan (tidak disediakan)

Bahan habis pakai

Boleh habis pakai Pembekal
0.2 mL tiub PCR atau tiub jalur Pembekal makmal am
Hujung pipet 20 mL (orifis standard dan lebar) Pembekal makmal am
Hujung pipet 200 mL (orifis standard dan lebar) Pembekal makmal am
Etanol 200 bukti (mutlak) untuk biologi molekul (500 mL) Sigma-Aldrich, # E7023
Air bebas nuclease Pembekal makmal am
AMPure XP Beckman, # A63880
Kit Analisis DNA Sensitiviti Tinggi Agilent Bioanalyzer* Agilent, # 5067-4626
TapeStation High Sensitiviti D5000 ScreenTape Assay* Agilent, # 5067-5592, #5067-5593
Kit Ujian Qubit dsDNA HS Thermo Fisher Scientific, # Q32851 atau Q32854
Tiub Uji Qubit Thermo Fisher Scientific, # Q32856
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific, # 65601, 65602 atau 65603
Agilent SureSelect XT HS Capture Library Human All Exon 7 Agilent, # G9704N, G9705N atau G9706N
Kit Pengayaan Sasaran Agilent SureSelect XT HS, Modul Hib ILM (Post PCR), 16 Rxn Agilent, #G9916B
Penampan TE, pH 8.0 Pembekal makmal am

*Bergantung pada sistem yang tersedia di kemudahan pengguna.

peralatan

peralatan Pembekal
Thermo Cycler Biosistem Gunaan
Pendirian magnet untuk tiub PCR 0.2 mL Pembekal makmal am
Pemutar Tiub Pembekal makmal am
Inkubator (untuk 35°C) Pembekal makmal am
Vortexer Pembekal makmal am
Microcentrifuge Pembekal makmal am
Penganalisis Bio Agilent* Agilent
Agilent TapeStation* Agilent
Qubit® Fluorometer 3.0 Thermo Fisher Scientific, # Q33216, Q33217 atau Q33218
Baldi Ais Pembekal makmal am
Penumpu Vakum SpeedVac (Pilihan) Thermo Fisher Saintifik

*Bergantung pada sistem yang tersedia di kemudahan pengguna.

Aliran Kerja Tangkapan Exome Manusia TELL-Seq™

TELL-Seq™ WGS Library Prep

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(14)

Protokol

TELL-Seq™ WGS Library Prep
Protokol berikut menerangkan prosedur penyediaan perpustakaan penjujukan keseluruhan genom TELL-Seq™ yang diubah suai dengan kit Prep Perpustakaan TELL-Seq™ menggunakan DNA manusia.amples. DNA genomik yang berbeza sampJenis le juga boleh digantikan mengikut protokol yang sama. Pustaka TELL-Seq™ serasi dengan sistem Pengayaan Sasaran lain, tetapi Sistem Pengayaan Sasaran HS Agilent SureSelectXT menggunakan SureSelect Human Semua probe tangkapan Exon V8 digunakan sebagai bekasampdalam protokol. Untuk digunakan dalam Sistem Pengayaan Sasaran lain, sila ikuti protokol untuk Persediaan Perpustakaan TELL-Seq™ (ms 10-22) untuk menjana perpustakaan yang sesuai. Perpustakaan TELL-Seq™ boleh digunakan sebagai Input DNA mengikut protokol setiap Sistem Pengayaan Sasaran khusus bersama-sama dengan Penyekat Sasaran TELL-Seq™ digunakan sebagai tambahan kepada penyekat yang ditentukan.

DNA kod bar

Bahan habis pakai
➢ Input DNA genomik (Pengguna)

Saiz Genom Jumlah Input Vol tindak balas (mL) Persediaan/Kit
Besar (Manusia) 5 ng 150 4

NOTA: 

  1. DNA genomik harus disimpan dan dicairkan dalam penimbal Tris dengan pH antara 7.5 hingga 8.0 atau penimbal TE rendah (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0).

➢ 5× Penampan Reaksi (Kotak Kit 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(7) biru)
➢ Kofaktor II (Kotak Kit 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(15) Amber)
➢ Enzim Pengekodan Bar (Kotak Kit 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(8) hitam)
➢ TELL Bead atau TELL Bead Plex (Kotak Kit 2, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(2) oren)
➢ Penampan Suspensi EZ (Kotak Kit 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4) semula jadi)
➢Air bebas nukleus (Pengguna)
➢ 0.2 mL tiub PCR atau tiub jalur (Pengguna)
➢20 µL dan 200 µL petua pipet orifis lebar (Pengguna)

Persediaan

  1. Sediakan bahan habis pakai berikut:
    item Penyimpanan Arahan
    5× Penampan Reaksi UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(7) -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran untuk bercampur, kemudian   sentrifuge secara ringkas. Teruskan di atas ais.
    Kofaktor II UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(15) -25°C hingga -15°C Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan di suhu bilik dalam gelap. Tutup tiub   tutup rapat selepas setiap penggunaan. 
    Enzim Pengekodan Bar UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(8) -25°C hingga -15°C Kuis tiub 4 hingga 5 kali untuk bercampur. Empar secara ringkas. Teruskan di atas ais.  
    BERITAHU Bead Plex UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(2) 2°C hingga 8°C Centrifuge secara ringkas. Teruskan atas ais. Tutup penutup tiub  ketat selepas setiap penggunaan untuk mengelakkan sebarang penyejatan.
    Penampan Suspensi EZ UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4) -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan di suhu bilik.
    Air bebas nuclease Suhu Bilik Simpan pada suhu bilik.
  2. Sediakan pemutar tiub dalam inkubator 35 °C (lihat Langkah 7 bahagian Prosedur).

AWAS
Gunakan petua pipet orifis lebar untuk memindahkan dan mencampurkan DNA genomik berat molekul tinggi untuk mengelakkan DNA pecah. Jika hujung pipet orifis lebar tidak tersedia, potong 2mm-3mm dari hujung atas pipet standard dengan pisau cukur bersih sebelum digunakan.

Prosedur

  1. Vortex TELL Bead Plex dengan kuat selama sekurang-kurangnya 30 saat. Putaran nadi (sentrifuge selama tidak lebih daripada 1 saat) untuk menurunkan larutan manik yang terdapat pada penutup atau sisi tiub. Sejurus sebelum digunakan, paipkan TELL Bead Plex dengan hujung 200 µL ke atas dan ke bawah 5 kali untuk memastikan semua manik digantung semula dengan betul.
  2. Dalam tiub PCR 0.2 mL, kumpulkan setiap tindak balas dalam susunan berikut.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas (mL)
    Genom Besar (150 mL)
    5× Penampan Reaksi UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(7) 30
    Air bebas nuclease
    Kofaktor II UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(15)    		 20 – Z
    (Z ialah voltan DNA)30
    BERITAHU Bead Plex UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(2) (0.5M kod bar/mL) 19
  3. Gaul rata dengan mepipet ke atas dan ke bawah selama 10 kali atau pusaran dengan kuat selama 5 saat dan putaran nadi untuk membawa larutan ke bawah. Tambah Enzim Pengekodan Bar.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas (mL)
    Genom Besar
    Enzim Pengekodan Bar UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(8) 6 mL
  4. Gaul rata dengan pipet atas dan bawah sebanyak 8 kali. Elakkan memasukkan buih udara semasa mepipet dengan mengekalkan hujung pipet di bahagian bawah larutan di dalam tiub.
  5. Gunakan hujung pipet orifis lebar, tambah reagen berikut.
    UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-25NOTA:     Penampan Suspensi EZ sangat likat. Gunakan berhati-hati dan pipet perlahan-lahan untuk memastikan volum yang betul dihantar.
  6. Tetapkan isipadu pipet pada 110 µL. Gunakan hujung pipet orifis lebar, campurkan larutan dengan perlahan-lahan dengan mepipet ke atas dan ke bawah 6-8 kali. Elakkan daripada memasukkan banyak buih udara semasa membuat paip dengan mengekalkan hujung pipet di bahagian bawah larutan di dalam tiub.
  7. Letakkan samptiub pada pemutar tiub dalam inkubator 35°C dan putar perlahan-lahan (10-15 rpm) selama 30 minit.

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(16)

Samptiub diletakkan pada Pemutar Tiub dalam inkubator 35°C.

Nota: Putaran tiub yang betul adalah penting untuk mengekalkan sifat DNA HMW dan untuk memudahkan proses pengekodan bar yang betul. Sistem pencampuran yang disyorkan ditunjukkan di bawah (sebelah kiri). Sistem pencampuran yang tidak berputar atau yang menghasilkan gegaran kuat tidak serasi dengan pemeliharaan sifat DNA HMW dan TELL-Seq; beberapa sistem ini juga ditunjukkan di bawah (sebelah kanan).

UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(17)

Menstabilkan DNA 

Bahan habis pakai
➢ Penstabil (Kotak Kit 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(18) Violet)

Persediaan

  1. Sediakan bahan habis pakai berikut:
item Penyimpanan Arahan
PenstabilUNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(18) -25°C hingga -15°C Kuis tiub 4 hingga 5 kali untuk bercampur. Sentrifuge secara ringkas. Teruskan di atas ais.

Prosedur

  1. Dapatkan semula samptiub daripada inkubator 35°C.
  2. Tambah Penstabil ke dalam tiub.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas (mL)
    Genom Besar
    Penstabil UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(18) 3
  3. Tetapkan isipadu pipet pada 110 µL. Gunakan hujung pipet orifis lebar, campurkan larutan dengan perlahan-lahan dengan mepipet ke atas dan ke bawah 6-8 kali. Elakkan membuat banyak buih.
  4. Letakkan samptiub kembali pada pemutar tiub dalam inkubator 35°C dan putarkannya perlahan-lahan (10-15 rpm) selama 30 minit.

TagDNA ment 

Bahan habis pakai
➢ TagEnzim ging (Kotak Kit 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(13) Merah)
➢ Exonuclease (Kotak Kit 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-24 Kuning)

Persediaan

  1. Sediakan bahan habis pakai berikut:
    item Penyimpanan Arahan
    Tagging Enzim UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(13) -25°C hingga -15°C Kuis tiub 4 hingga 5 kali untuk bercampur. Empar secara ringkas. Teruskan di atas ais.
    Exonuclease UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-24 -25°C hingga -15°C Kuis tiub 4 hingga 5 kali untuk bercampur. Empar

    secara ringkas. Teruskan di atas ais.
  2. Gunakan pemutar tiub yang sama dalam inkubator 35 °C.

Prosedur

  1. Dapatkan semula samptiub daripada inkubator 35°C.
  2. Tambah Tagmemasukkan Enzim dan Eksonuklease ke dalam tiub.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas (mL)
    Genom Besar
    Tagging Enzim UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(13) 2
    Exonuclease UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-24 3
  3. Tetapkan isipadu pipet pada 110 µL. Gunakan hujung pipet orifis lebar, campurkan larutan secara perlahan-lahan dengan mepipet ke atas dan ke bawah secara perlahan-lahan sebanyak 8 kali. Untuk langkah ini, pencampuran perlu sangat teliti. Elakkan membuat banyak buih.
  4. Letakkan samptiub kembali pada pemutar tiub dalam inkubator 35°C dan putarkannya perlahan-lahan selama 10 minit. Apabila perlu, jumlah yang berbeza Tagging Enzim boleh digunakan untuk melaraskan saiz perpustakaan.
    NOTA: Jika pustaka sisipan yang lebih panjang diutamakan, kurangkan jumlah Tagging Enzim boleh digunakan dalam tindak balas. Sebaliknya, jika perpustakaan sisipan yang lebih pendek lebih disukai, sehingga 6µL Tagging Enzim boleh digunakan dalam tindak balas.
  5. Teruskan ke langkah seterusnya sejurus selepas pengeraman.

Basuh Manik

Bahan habis pakai

  • Hentikan Penyelesaian (Kotak Kit 2, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4) Asli atau disimpan pada suhu bilik selepas penggunaan pertama)
  • Larutan Basuh (Kotak Kit 2, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) putih)
  • 0.2 mL tiub PCR atau tiub jalur (Pengguna)

Persediaan

  1. Sediakan bahan habis pakai berikut:
    item Penyimpanan Arahan
    Hentikan Penyelesaian UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4) 2°C hingga 25°C Semak sebarang endapan. Jika ada, eramkan penimbal pada suhu 37°C selama 10 minit, dan vorteks sehingga ia larut. Simpan pada suhu bilik untuk  kegunaan masa hadapan.
    Penyelesaian Basuh UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) 2°C hingga 8°C Bawa ke suhu bilik.
  2. Sediakan kitar termo dengan program berikut:
    • Panaskan pilihan penutup hingga 100°C
    • 63°C selama-lamanya

Prosedur

  1. Letakkan samptiub pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  2. Semasa tiub berada pada dirian magnet, aspirat dan buang supernatan tanpa mengganggu manik.
  3. Keluarkan tiub dari pendirian magnet. Tambah 120 µL Wash Solution pada sample tiub. Pipet untuk menggantung semula manik. Jika perlu, putaran nadi untuk menurunkan penyelesaian.
  4. Letakkan samptiub kembali pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  5. Semasa tiub berada pada dirian magnet, aspirat dan buang supernatan tanpa mengganggu manik.
  6. Keluarkan tiub dari pendirian magnet. Tambah 80 µL Stop Solution ke dalam tiub.
  7. Pipet beberapa kali untuk menggantung semula manik. Jika perlu, putaran nadi untuk menurunkan penyelesaian.
  8. Inkubasi tiub pada suhu bilik selama 5 minit.
  9. Letakkan samptiub kembali pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  10. Semasa tiub berada pada dirian magnet, aspirat dan buang supernatan tanpa mengganggu manik.
  11. Keluarkan tiub dari pendirian magnet. Tambah 120 µL Wash Solution ke dalam tiub PCR. Pipet untuk menggantung semula manik.
  12. Pindahkan semua larutan manik ke dalam tiub PCR 0.2ml baharu.
  13. Inkubasi tiub pada suhu 63 °C pada PCR thermocycler selama 3 minit.
  14. Letakkan s baruamptiub pada dirian magnet pada suhu bilik selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  15. Semasa tiub berada pada dirian magnet, aspirat dan buang supernatan tanpa mengganggu manik.
  16. Keluarkan tiub dari pendirian magnet. Tambah 120 µL Wash Solution ke dalam tiub PCR. Pipet untuk menggantung semula manik. Jika perlu, putaran nadi untuk menurunkan penyelesaian.
  17. Inkubasi tiub pada suhu 63 °C pada PCR thermocycler selama 3 minit.
  18. Letakkan samptiub pada dirian magnet pada suhu bilik selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  19. Semasa tiub berada pada dirian magnet, aspirasi dan buang supernatan tanpa mengganggu manik. Gunakan pipet P20 untuk mengeluarkan sebarang supernatan yang tinggal.
  20. Keluarkan tiub dari pendirian magnet. Gantungkan semula manik dalam 20 µL Larutan Cuci.

NOTA
Ini adalah TITIK BERHENTI SELAMAT. Manik yang telah dibasuh boleh disimpan pada suhu 2°C hingga 8°C selama dua minggu.

AmpPerpustakaan lify

Bahan habis pakai

  • 2× Campuran Induk PCR (Kotak Kit 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(19) merah jambu)
  • 10× Primer I (Kotak Kit 1,  UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3)putih)
  • 10× Primer II, T50# (Multiplex Primer Kit)
  • Air tanpa nukleus (Pengguna)
  • 0.2 mL tiub PCR atau tiub jalur (Pengguna)

Persediaan

  1. Sediakan bahan habis pakai berikut:
    item Penyimpanan Arahan
    2× Campuran Induk PCR UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(19) -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Kuis tiub 4 hingga 5  kali sebati, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan di atas ais.    
    10× Primer I UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge secara ringkas. Teruskan di atas ais. 
    10× Primer II, T50# -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran untuk bercampur, kemudian  sentrifuge secara ringkas. Teruskan di atas ais. 
    Penambah UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(20) -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge secara ringkas. Simpan pada suhu bilik. 
    Air bebas nuclease Suhu Bilik Simpan pada suhu bilik.
  2. Sediakan Perpustakaan AmpProgram lifikasi (LAP) pada kitar termo seperti berikut:
    • 63°C 2 minit
    • 72°C 2 minit
    • 98°C 30 saat
    • [98°C 15 saat, 63°C 20 saat, 72°C 30 saat] x Nombor Kitaran
    • 72°C 3 minit
    • 4°C selama-lamanya

NOTA:
Nombor kitaran adalah fleksibel berdasarkan aplikasi dan keperluan hiliran. Syorkan bermula dengan 13 kitaran. Nombor kitaran yang lebih tinggi akan menjana lebih banyak perpustakaan TELL-Seq sebagai input untuk Hibridisasi dan Tangkapan, tetapi kadar penduaan yang lebih tinggi untuk analisis penjujukan akhir. Nombor kitaran yang lebih rendah boleh mengurangkan kadar pertindihan, tetapi input DNA yang lebih rendah boleh mengakibatkan penurunan kecekapan penangkapan dan mengurangkan kerumitan perpustakaan. Sila rujuk pada akhir Perpustakaan Kelayakan dan Kuantiti untuk Hibridisasi dan Tangkapan untuk pertimbangan selanjutnya apabila menentukan nombor kitaran yang sesuai.

Saiz Genom Vol of Beads Digunakan (B) untuk PCR Isipadu PCR Nombor Kitaran
besar 20 mL 75 mL 12-14

Prosedur

  1. Manik vorteks dengan kuat selama 10 saat untuk menggantung semula manik. Putaran nadi untuk menurunkan penyelesaian. Menggunakan hujung 20 µL, paipkan manik ke atas dan ke bawah 5 kali untuk memastikan semua manik digantung semula dengan betul. Segera pindahkan keseluruhan jumlah larutan manik ke tiub PCR baharu.
  2. Letakkan tiub PCR pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  3. Semasa tiub berada pada dirian magnet, keluarkan 20 µ L supernatan tanpa mengganggu manik. Keluarkan tiub PCR daripada magnet.
  4. Tambah reagen berikut ke dalam tiub PCR.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas (µL)
    Genom Besar (75 µL)
    Air bebas nuclease 16 mL
    2× Campuran Induk PCR UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(19) 37.5 mL
    10× Primer I UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) 7.5 mL
    10× Primer II, T50# 7.5 mL
    Penambah UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(20) hijau 4.5 mL
  5. Gaul sebati dengan mempusing atau mepipi. Putaran nadi untuk menurunkan penyelesaian.
  6. Letakkan tiub pada kitaran haba dan jalankan program LAP (lihat di atas) dengan bilangan kitaran yang betul.
  7. Selepas PCR amplifikasi, gunakan 2 µL produk PCR untuk pemeriksaan kualiti pada Bioanalyzer atau TapeStation. Lihat bahagian Kelayakan dan Kuantiti Perpustakaan untuk arahan.

PETUA PRO: Jika semakan QC menunjukkan hasil perpustakaan adalah agak rendah, letakkan tiub dengan baki produk PCR kembali ke mesin termos dan amphidupkan untuk satu atau dua kitaran tambahan lagi sebelum beralih ke bahagian Bersihkan Perpustakaan.

NOTA:
Ini adalah TITIK BERHENTI SELAMAT. Produk PCR boleh disimpan pada suhu -25°C hingga -15°C selama satu bulan.

Bersihkan Perpustakaan

Bahan habis pakai

  • AMPure XP (Pengguna)
  • Bukti etanol 200 (mutlak) untuk biologi molekul (Pengguna)
  • Air tanpa nukleus (Pengguna)
  • 0.2 mL tiub PCR atau tiub jalur (Pengguna)

Persediaan

  1. Sediakan bahan habis pakai berikut:
item Penyimpanan Arahan
Etanol 75% (v/v) segar Suhu Bilik Memerlukan 400 mL setiap sample. Campurkan 1.5 mL Etanol (200 kalis) dengan 0.5 mL air tanpa Nuklease. Pusaran untuk dicampur dan disimpan pada suhu bilik.
AMPure XP 2°C hingga 8°C Bawa ia ke suhu bilik selama sekurang-kurangnya 20 minit dan vorteks dengan kuat untuk menggantung semula manik sebelum digunakan.
Air bebas nuclease Suhu Bilik Simpan pada suhu bilik.
Penampan TE, pH 8.0 Suhu Bilik Simpan pada suhu bilik.

Prosedur

  1. Sentrifuge secara ringkas samptiub PCR untuk menurunkan semua penyelesaian.
  2. Letakkan tiub pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  3. Semasa tiub berada pada dirian magnet, pindahkan supernatan ke tiub PCR 0.2 mL yang baru tanpa mengganggu manik.
  4. Ukur isipadu supernatan yang dipindahkan (produk PCR) dengan pipet.
  5. Tambah reagen berikut ke dalam produk PCR kepada jumlah isipadu 100 µL.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas
    produk PCR 75 mL
    Air bebas nuclease Untuk jumlah akhir 100 mL
  6. Vortex dengan kuat untuk menggantung semula AMPpenyelesaian ure XP dan tambah 78 µL AMPure XP ke dalam produk PCR 100 µL.
  7. Gaulkan dengan paip ke atas dan ke bawah sebanyak 10 kali.
  8. Inkubasi pada suhu bilik selama 5 minit.
  9. Letakkan tiub pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  10. Sedut dan buang supernatan tanpa mengganggu AMPmanik ure.
  11. Semasa menyimpan tiub pada dirian magnet, tambahkan 200 µL etanol 75% yang baru disediakan ke dalam tiub. Biarkan selama 30 saat.
  12. Sedut dan buang supernatan tanpa mengganggu manik.
  13. Ulangi langkah 11-12 sekali lagi, pastikan tiub pada dirian magnet sepanjang masa.
  14. Simpan tiub pada dirian magnet dengan penutup terbuka dan biarkan tiub kering selama 1-2 minit untuk menyejat kesan etanol. JANGAN terlalu keringkan manik.
  15. Keluarkan tiub dari dirian magnet dan tambahkan 20 µL air bebas nuklease pada manik.
  16. Pipet atau pusaran untuk menggantung semula manik. Biarkan selama 5 minit.
  17. Letakkan tiub pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  18. Pulihkan 18 µL supernatan ke dalam tiub baru. Berhati-hati agar tidak mengganggu manik.
  19. Supernatan mengandungi perpustakaan TELL-Seq™.

NOTA:
Ini adalah TITIK BERHENTI SELAMAT. Pustaka TELL-Seq yang telah dimurnikan boleh disimpan pada suhu -25°C hingga -15°C selama sebulan.

Layakkan dan Kirakan Perpustakaan untuk Pengayaan Sasaran

Bahan habis pakai

  • Kit DNA Kepekaan Tinggi Agilent atau Ujian Pita Skrin D5000 TapeStation Kepekaan Tinggi (Pengguna)
  • Kit Ujian Qubit dsDNA HS (Pengguna)
  • Penampan TE, pH 8.0 (Pengguna)

NOTA:
Ujian kuantiti perpustakaan qPCR standard untuk sistem Illumina berfungsi untuk perpustakaan TELL-Seq, tetapi ia tidak diperlukan.

Persediaan

  1. Sediakan bahan guna habis yang diperlukan seperti yang diperlukan oleh Bioanalyzer atau TapeStation dan Qubit.

Prosedur

  1. Gunakan 1 µL pustaka untuk Kit DNA Kepekaan Tinggi Agilent atau 2 µL pustaka untuk TapeStation High Sensitiviti D5000 ScreenTape Assay.
  2. Semak produk PCR yang tidak dibersihkan yang disimpan daripada Amplify bahagian Perpustakaan pada masa yang sama. Produk PCR yang tidak dibersihkan mungkin mempunyai tahap dimer primer dan dimer penyesuai yang tinggi. Ia memerlukan pencairan dua kali ganda dengan air bebas nuklease sebelum dimuatkan pada cip Bioanalyzer atau pita TapeStation untuk mengelak daripada mengganggu isyarat penanda yang lebih rendah.
  3. Perpustakaan bersaiz baik harus mempunyai kebanyakan serpihan perpustakaan di bawah 1000 bp (Rajah 1).UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(21)Rajah 1. Seorang bekasample of cleaned up library profile daripada ujian Pita Skrin D5000 Kepekaan Tinggi TapeStation.
  4. Perpustakaan boleh disimpan pada suhu -25°C hingga -15°C.
  5. Buat perpustakaan TELL-Seq™ yang dicairkan 10 kali gandaample: cairkan 2 µL perpustakaan TELL-Seq™ dengan 18 µL air bebas nuklease. Gunakan 4 µL perpustakaan yang dicairkan untuk memeriksa kepekatan dengan Kit Ujian Qubit dsDNA HS.
  6. Gunakan kepekatan (ng/µL) dan volum untuk mengira jumlah jisim setiap Perpustakaan TELL-Seq™ yang masuk ke dalam proses Sistem Pengayaan Sasaran SureSelectXT HS. 500 ng -1,000 ng perpustakaan TELL-Seq™ setiap sample disyorkan untuk hasil yang optimum, tetapi input perpustakaan serendah 250 ng per sampadalah mungkin walaupun prestasi boleh terjejas secara negatif.
    NOTA:
    Terdapat kekangan volum untuk protokol Hibridisasi dan Tangkapan. 12 µL ialah isipadu maksimum yang dibenarkan untuk input DNA. Pertimbangan yang teliti harus digunakan untuk memastikan volum perpustakaan DNA berada dalam julat ini. Sebaik-baiknya gunakan semua bahan perpustakaan TELL-Seq yang tersedia selepas QC ke dalam tindak balas Hibridisasi dan Tangkapan.
  7. (Pilihan) Perpustakaan TELL-Seq™ boleh ditumpukan menggunakan SpeedVac Vacuum Concentrator. Jika SpeedVac akan digunakan untuk menumpukan perpustakaan, perpustakaan TELL-Seq™ selepas itu AMPPembersihan XP boleh dielusi daripada manik XP dengan sekurang-kurangnya 30 µL air bebas nuklease untuk pemulihan yang lebih baik. Selepas QC, perpustakaan TELL-Seq™ yang bersih boleh ditumpukan kepada volum yang dikehendaki untuk Hibridisasi dan Tangkapan.

NOTA:
Sistem Pengayaan Sasaran lain boleh digunakan seperti IDT dan Twist Biosciences menggunakan perpustakaan TELL-Seq™ yang dicipta. Ikuti protokol Pengayaan Sasaran yang ditentukan menggunakan perpustakaan TELL-Seq™ sebagai Input DNA. Gunakan 5ul TELL-Seq™ TargetSeq Blocker sebagai tambahan kepada penyekat terperinci dalam setiap protokol.

Pengayaan Sasaran SureSelect
Protokol berikut ialah pengubahsuaian bahagian Hibridisasi dan Tangkapan Sistem Pengayaan Sasaran SureSelect XT HS untuk Protokol Perpustakaan Penjujukan Berganda Berpasangan-End Illumina (Agilent, G9702-90000). Pengubahsuaian membenarkan keserasian TELL-Seq™ WGS Library Prep dengan Agilent SureSelect XT HS Target Enrichment System dan All Exon V8 Capture Probe. Reagen agilent untuk Hibridisasi dan Tangkap sahaja boleh dibeli secara berasingan dalam format 16 tindak balas (Nombor Bahagian Agilent G9916B). Jika menggunakan Sistem Pengayaan Sasaran lain ikut protokol yang ditetapkan untuk setiap sistem dan menggantikan perpustakaan TELL-Seq™ sebagai Input DNA. 5ul Penyekat Sasaran TELL-Seq™ juga diperlukan sebagai tambahan kepada penyekat terperinci dalam setiap protokol Pengayaan Sasaran

Hibrid Perpustakaan TELL-Seq™ kepada Panel Tangkapan Exome

Bahan habis pakai

  • Campuran Penyekat Input Rendah SureSelect XT HS dan XT, 16 Rxn (Agilent, Kit Pengayaan Sasaran SureSelect XT HS, Modul ILM Hyb, Kotak 2 (Post PCR), UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(7) biru)
  • Blok SureSelect RNase, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Kotak 2 (Post PCR), UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(18) Violet)
  • SureSelect Fast Hybridization Buffer, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Kotak 2 (Post PCR), Botol)
  • Penyekat Sasaran TELL-Seq™ (UST, Kotak Penyekat Sasaran TELL-Seq™, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) putih)
  • SSel XT HS dan XT Input Rendah Manusia Semua Exon V7 (Agilent, SSel XT HS dan XT Input Rendah Manusia Semua Exon V7, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(13) Merah)
  • Air tanpa nukleus (Pengguna)
  • 0.2 mL tiub PCR atau tiub jalur (Pengguna)
  • Perpustakaan TELL-Seq™ (Pengguna)
Jumlah Input Vol tindak balas (mL)
500 -1,000 ng Sehingga 12 mL

Persediaan

  1. Sediakan bahan habis pakai berikut:
    item Penyimpanan Arahan
    Campuran Penyekat Input Rendah SureSelect XT HS dan XT UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-26 -25°C hingga -15°C Cairkan pada ais. Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan di atas ais.
    SureSelect RNase Block UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(22) -25°C hingga -15°C Cairkan pada ais. Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge  secara ringkas. Teruskan di atas ais.
    Penampan Hibridisasi Pantas SureSelect -25°C hingga -15°C Cairkan dan simpan pada suhu bilik
    TELL-Seq™ Penghalang TargetSeq -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan atas ais.
    TELL-Seq™ Perpustakaan DNA -25°C hingga -15°C Cairkan dan simpan dalam ais
    SSel XT HS dan XT Input Rendah Manusia Semua Exon V8 UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(13) -85°C hingga -75°C Cairkan pada ais. Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan di atas ais.
  2. Sediakan Program Hibridisasi (HP) pada pengitar termo (dengan penutup yang dipanaskan HIDUP) dengan program di bawah. Mulakan program, kemudian segera tekan butang Jeda, membenarkan penutup yang dipanaskan mencapai suhu semasa anda menyediakan tindak balas.
Nombor Segmen Bilangan Kitaran Suhu Masa
1 1 95°C 5 minit
2 1 65°C 10 minit
3 1 65°C 1 minit
4 60 65°C
37°C		 1 minit
3 saat
5 1 65°C tahan

Prosedur

  1. Letakkan 500–1000 ng setiap perpustakaan TELL-Seq™ yang disediakanample ke dalam telaga tiub jalur dan kemudian bawa isipadu akhir dalam setiap telaga kepada 12 µl menggunakan air bebas nuklease jika diperlukan. Sebaik-baiknya buat jumlah ampDNA perpustakaan TELL-Seq™ yang diperakui, dalam julat 500–1000 ng dan gunakan semua untuk tindak balas hibridisasi.
  2. Kepada setiap perpustakaan TELL-Seq™ sampBaiklah, tambah 5 µl Campuran Penghalang Input Rendah SureSelect XT HS dan XT dan tambah 5 µl Penyekat Sasaran TELL-Seq™. Tutup telaga kemudian vorteks pada kelajuan tinggi selama 5 saat. Putar tiub jalur sebentar untuk mengumpul cecair membebaskan sebarang buih.
  3. Pindahkan tiub ke kitar haba dan tekan butang Main untuk menyambung semula atur cara HP.
    NOTA:
    Kitar haba mesti dijeda semasa Segmen 3 (lihat HP) untuk membenarkan reagen tambahan ditambahkan ke telaga Hibridisasi, seperti yang diterangkan dalam langkah 6. Semasa Segmen 1 dan 2 program kitar haba, mulakan menyediakan reagen tambahan seperti yang diterangkan dalam langkah 4 dan langkah 5. Jika perlu, anda boleh menyelesaikan langkah-langkah penyediaan ini selepas menjeda kitar haba dalam Segmen 3.
  4. Sediakan larutan 25% daripada Blok RNase SureSelect (mengandungi 1 isipadu Blok RNase dengan 3 isipadu air), mengikut jadual di bawah. Sediakan jumlah yang diperlukan untuk bilangan tindak balas hibridisasi dalam larian, ditambah lebihan.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas (mL)
    Kelantangan untuk 1 Reaksi Isipadu untuk 8 tindak balas (termasuk lebihan) Isipadu untuk 24 tindak balas (termasuk lebihan)
    SureSelect RNase Block UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(18) 0.5 mL 4.5 mL 12.5 mL
    Air bebas nuclease 1.5 mL 13.5 mL 37.5 mL
  5. Sediakan Campuran Hibridisasi Perpustakaan Tangkap dalam susunan berikut.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas (mL)
    Kelantangan untuk 1 Reaksi Isipadu untuk 8 tindak balas (termasuk lebihan) Isipadu untuk 24 tindak balas (termasuk lebihan)
    Penyelesaian Blok RNase 25% 2 mL 18 mL 50 mL
    SSel XT HS dan XT Input Rendah

    Manusia Semua Exon V7 UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(13)

    		 5 mL 45 mL 125 mL
    Penampan Hibridisasi Pantas SureSelect 6 mL 54 mL 150 mL

    Satukan reagen yang disenaraikan pada suhu bilik. Gaul rata dengan memutar pada kelajuan tinggi selama 5 saat kemudian putar ke bawah sebentar. Teruskan segera ke langkah 6.

  6. Sebaik sahaja kitar haba memulakan Segmen 3 HP (1 minit pada 65°C), tekan butang Jeda. Dengan penunggang dijeda, dan sambil mengekalkan DNA + Blocker samples dalam kitar, pindahkan 13 µl suhu bilik Capture Library Hybridization Mix dari langkah 6 ke setiap sample baik. Gaul rata dengan mepipit ke atas dan ke bawah perlahan-lahan 8 hingga 10 kali. Telaga tindak balas hibridisasi kini mengandungi kira-kira 35 µl
  7. Pastikan semua telaga ditutup sepenuhnya. Pusaran sekejap, kemudian putar tiub jalur sebentar untuk mengeluarkan sebarang buih dari bahagian bawah telaga. Segera kembalikan tiub jalur kepada kitar haba.
  8. Tekan butang Main untuk menyambung semula program kitaran haba bagi membolehkan penghibridan DNA yang disediakanamples ke Perpustakaan Tangkap.

Sediakan Manik Magnet bersalut Streptavidin

Bahan habis pakai

  • Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Pengguna)
  • SureSelect Binding Buffer (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Kotak 1 (Post PCR), CAP)

Persediaan

Sediakan bahan habis pakai berikut:

item Penyimpanan Arahan
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 2°C hingga 8°C Sentrifuge dengan kuat. Simpan pada suhu bilik.
Penampan Pengikat SureSelect, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) Suhu Bilik Simpan pada suhu bilik.

Prosedur

  1. Menggantung semula manik magnet Dynabeads MyOne Streptavidin T1 dengan kuat pada pengadun vorteks. Manik magnet mendap semasa penyimpanan.
  2. Bagi setiap hibridisasi sampKemudian, tambahkan 50 µl manik yang digantung semula ke dalam perigi plat PCR segar atau tiub jalur.
  3. Basuh manik dengan menambah 200 µl SureSelect Binding Buffer. Campurkan dengan paip ke atas dan ke bawah 20 kali atau tutup telaga dan pusaran pada kelajuan tinggi selama 5–10 saat.
  4. Letakkan plat atau tiub jalur ke dalam peranti pemisah magnetik.
  5. Tunggu sekurang-kurangnya 5 minit atau sehingga larutan jernih, kemudian keluarkan dan buang supernatan.
  6. Ulangi Langkah 3-5 dua kali lagi untuk 3 kali cucian.
  7. Gantungkan semula manik dalam 200 µl SureSelect Binding Buffer.

Tangkap DNA Hibrid menggunakan Manik bersalut Streptavidin

Bahan habis pakai

  • SureSelect Wash Buffer 1, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Kotak 1 (Post PCR), UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3))
  • SureSelect Wash UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) Penampan 2, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Kotak 1 (Post PCR), UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3))

Persediaan

Sediakan bahan habis pakai berikut:

item Penyimpanan Arahan
SureSelect Wash Buffer 1, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) Suhu Bilik Simpan pada suhu bilik.
SureSelect Wash Buffer 2, UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(3) Suhu Bilik Panaskan 200 µl aliquot pada 70°C. Lihat Langkah 4

Prosedur

  1. Selepas langkah penghibridan selesai dan kitar haba mencapai tahap tahan 65°C, pindahkan sampkurang ke suhu bilik.
  2. Segera pindahkan keseluruhan isipadu (kira-kira 30 µl) setiap campuran hibridisasi ke telaga yang mengandungi 200 µl manik streptavidin yang telah dibasuh menggunakan pipet berbilang saluran. Pipet ke atas dan ke bawah 5-8 kali untuk bercampur.
  3. Inkubasi tiub jalur tangkap pada pengadun plat telaga 96, gaul kuat-kuat (pada 1400–1800 rpm) atau pemutar, selama 30 minit pada suhu bilik. Pastikan samples betul-betul bercampur di dalam telaga.
  4. Teruskan ke langkah seterusnya sejurus selepas pengeraman. Semasa pengeraman selama 30 minit untuk tangkapan, suamkan SureSelect Wash Buffer 2 pada suhu 70°C seperti yang diterangkan di bawah. Letakkan 200 µl aliquot Wash Buffer 2 dalam perigi plat 96- telaga atau tiub jalur yang baru. Aliquot 6 telaga penimbal untuk setiap DNA sample dalam pelarian. Tutup perigi dan kemudian inkubasi dalam pengitar haba, dengan penutup yang dipanaskan HIDUP, dipegang pada 70°C sehingga digunakan dalam
  5. Apabila tempoh pengeraman 30 minit yang dimulakan dalam Langkah 3 selesai, putar samples secara ringkas untuk mengumpul cecair.
  6. Letakkan tiub jalur dalam pemisah magnet untuk mengumpul manik. Tunggu sehingga larutan jernih, kemudian keluarkan dan buang supernatan.
  7. Gantungkan semula manik dalam 200 µl SureSelect Wash Buffer 1. Campurkan dengan mepipet ke atas dan ke bawah 15–20 kali, sehingga manik digantung semula sepenuhnya.
  8. Letakkan tiub jalur dalam pemisah magnetik. Tunggu sehingga larutan menjadi jelas (kira-kira 1 minit), kemudian keluarkan dan buang supernatan.
  9. Keluarkan tiub jalur dari pemisah magnetik dan pindahkan ke rak pada suhu bilik. Gantungkan semula manik dalam 200 µl 70°C Penimbal Basuh yang telah dipanaskan terlebih dahulu 2. Pipet ke atas dan ke bawah 15–20 kali, sehingga manik digantung semula sepenuhnya. Tutup telaga dengan penutup baru dan kemudian vorteks pada kelajuan tinggi selama 8 saat. Putar pinggan atau tiub jalur secara ringkas untuk mengumpul cecair tanpa meletupkan manik.
  10. Inkubasi samples selama 5 minit pada suhu 70°C pada kitar haba dengan penutup yang dipanaskan dihidupkan.
  11. Letakkan tiub jalur dalam pemisah magnet pada suhu bilik. Tunggu 1 minit untuk penyelesaiannya jelas, kemudian keluarkan dan buang supernatan.
  12. Ulangi Langkah 9-11 lima kali lagi, untuk 6 kali cucian.
  13. Selepas mengesahkan bahawa semua penimbal pencuci telah dialihkan, tambah 25 µl air bebas nuklease ke setiap sample baik. Pipet ke atas dan ke bawah 8 kali untuk menggantung semula manik. Samples boleh disimpan di atas ais sebelum amppemberitahuan

AmpPerpustakaan Ditangkap lify

Bahan habis pakai

  • Penampan Reaksi 5× Herculase II (Agilent, Kit Pengayaan Sasaran SureSelect XT HS, Kotak Modul Hib ILM 2 (Post PCR), CAP Clear)
  • Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent, Kit Pengayaan Sasaran SureSelect XT HS, Kotak Modul Hib ILM 2 (Post PCR), CAP Red)
  • Campuran dNTP 100 mM, (Agilent, Kit Pengayaan Sasaran SureSelect XT HS, Kotak Modul Hib ILM 2 (Post PCR), CAP Hijau)
  • Campuran Primer Pasca Tangkap SureSelect (Agilent, Kit Pengayaan Sasaran SureSelect XT HS, Kotak Modul Hib ILM 2 (Post PCR), CAP Clear)

Persediaan

  1. Sediakan bahan habis pakai berikut:
    item Penyimpanan Arahan
    5× Penampan Reaksi Herculase II UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4) -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran ke gaul, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan di atas ais.     
    Polimerase DNA Gabungan Herculase II UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(13) -25°C hingga -15°C Centrifuge secara ringkas. Teruskan atas ais.
    100 mM dNTP Campuran UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(20) -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran ke  gaul, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan di atas ais.     
    Campuran Primer Pasca Tangkap SureSelect UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4) -25°C hingga -15°C Cairkan pada suhu bilik. Pusaran untuk bercampur, kemudian sentrifuge sebentar. Teruskan atas ais.
  2. Sediakan atur cara berikut pada kitar termo seperti berikut:
    • 98°C 2 minit
    • [98°C 30 saat, 63°C 30 saat, 72°C 1 minit] x 9
    • 72°C 5 minit
    • 4°C selama-lamanya

Prosedur

  1. Sediakan isipadu campuran tindak balas PCR yang sesuai. Tambah reagen berikut ke dalam tiub PCR berdasarkan bilangan tindak balas.
    Reagen Isipadu setiap tindak balas (µL)
    Kelantangan untuk 1 Reaksi Isipadu untuk 8 tindak balas (termasuk lebihan) Isipadu untuk 24 tindak balas (termasuk lebihan)
    Air bebas nuclease 12.5 µL 112.5 µL 312.5 µL
    5× Penampan Reaksi Herculase IIUNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4) 10 µL 90 µL 250 µL
    Polimerase DNA Gabungan Herculase II UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-27 1 µL 9 µL 25 µL
    100 mM dNTP Campuran UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(20) 0.5 µL 4.5 µL 12.5 µL
    Campuran Primer Pasca Tangkap SureSelect UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(4) 1 µL 9 µL 25 µL
  2. Sediakan isipadu campuran tindak balas PCR yang sesuai. Tambah reagen berikut ke dalam tiub PCR berdasarkan bilangan tindak balas. Tambah 25 µl campuran tindak balas PCR yang disediakan dalam Jadual 29 kepada setiap samptelaga yang mengandungi 25 µl DNA yang diperkaya sasaran terikat manik (disediakan pada halaman 26 dan dipegang di atas ais).
  3. Campurkan tindak balas PCR dengan baik dengan mepipet ke atas dan ke bawah sehingga ampaian manik menjadi homogen. Elakkan percikan samples ke dinding telaga; jangan putar samples pada langkah ini.
  4. Letakkan tiub pada kitaran haba dan jalankan program (lihat di atas) dengan bilangan kitaran yang betul.
  5. Apabila PCR ampprogram lifikasi selesai, putar tiub jalur secara ringkas. Tanggalkan manik bersalut streptavidin dengan meletakkan plat atau tiub jalur pada dirian magnet pada suhu bilik. Tunggu 2 minit untuk larutan menjadi jelas, kemudian keluarkan setiap supernatan (kira-kira 50 µl) ke telaga tiub jalur.

Bersihkan Perpustakaan yang Dirakam 

Bahan habis pakai

  • AMPure XP (Pengguna)
  • Bukti etanol 200 (mutlak) untuk biologi molekul (Pengguna)
  • Air tanpa nukleus (Pengguna)
  • Penampan TE, pH 8.0 (Pengguna)
  • 0.2 mL tiub PCR atau tiub jalur (Pengguna)

Persediaan

Sediakan bahan habis pakai berikut:

item Penyimpanan Arahan
Etanol 75% (v/v) segar Suhu Bilik Memerlukan 400 mL setiap sample. Campurkan 1.5 mL Etanol (200 kalis) dengan 0.5 mL air tanpa Nuklease. Pusaran untuk dicampur dan disimpan pada suhu bilik.
AMPure XP 2°C hingga 8°C Bawa ia ke suhu bilik selama sekurang-kurangnya 20 minit dan vorteks dengan kuat untuk menggantung semula manik sebelum digunakan.
Air bebas nuclease Suhu Bilik Simpan pada suhu bilik.
Penampan TE, pH 8.0 Suhu Bilik Simpan pada suhu bilik.

Prosedur

  1. Turunkan larutan dengan putaran cepat ~1 saat dalam emparan.
  2. Vortex dengan kuat untuk menggantung semula AMPpenyelesaian ure XP dan tambah 50 µL AMPure XP ke dalam setiap produk PCR.
  3. Gaulkan dengan paip ke atas dan ke bawah sebanyak 10 kali.
  4. Inkubasi pada suhu bilik selama 5 minit.
  5. Letakkan tiub pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  6. Sedut dan buang supernatan tanpa mengganggu AMPmanik ure.
  7. Semasa menyimpan tiub pada dirian magnet, tambahkan 200 µL etanol 75% yang baru disediakan ke dalam tiub. Biarkan selama 30 saat.
  8. Sedut dan buang supernatan tanpa mengganggu manik.
  9. Ulangi langkah 7-8 sekali lagi, pastikan tiub pada dirian magnet sepanjang masa.
  10. Biarkan tiub pada dirian magnet dengan penutup terbuka dan biarkan tiub kering selama 1-2 minit untuk menyejat kesan etanol. JANGAN terlalu keringkan manik.
  11. Keluarkan tiub dari dirian magnet dan tambahkan penimbal 25 µL TE pada manik.
  12. Pipet atau pusaran untuk menggantung semula manik. Biarkan selama 5 minit.
  13. Letakkan tiub pada dirian magnet selama 1 minit atau sehingga larutan jernih.
  14. Pulihkan 23 µL supernatan ke dalam tiub baru. Berhati-hati agar tidak mengganggu manik.
  15. Supernatan mengandungi perpustakaan TELL-Seq™ yang ditangkap.

NOTA:
Ini adalah TITIK BERHENTI SELAMAT. Perpustakaan TELL-Seq yang ditangkap boleh disimpan pada suhu -25°C hingga -15°C selama enam bulan.

Layakkan dan Kirakan Perpustakaan yang Ditangkap untuk Penjujukan

Bahan habis pakai

  • Agilent Bioanalyzer Kit DNA Kepekaan Tinggi atau TapeStation Kepekaan Tinggi D5000 Ujian Pita Skrin (Pengguna)
  • Kit Ujian Qubit dsDNA HS (Pengguna)
  • Penampan TE, pH 8.0 (Pengguna)

Persediaan

  1. Sediakan bahan guna habis yang diperlukan seperti yang diperlukan oleh Bioanalyzer atau TapeStation dan Qubit.

Prosedur

  1. Gunakan 1 µL perpustakaan untuk Kit DNA Kepekaan Tinggi Agilent Bioanalyzer atau 2 µL perpustakaan untuk TapeStation High Sensitiviti D5000 ScreenTape Assay.
  2. Untuk menentukan kepekatan perpustakaan, tetapkan Rantau pada perisian analisis Bioanalyzer atau TapeStation daripada 150 bp kepada 1000 bp. Rekod sample Kepekatan (nM) untuk rantau ini (lihat Rajah 2). Untuk menentukan saiz perpustakaan, tetapkan Rantau daripada 150 bp kepada 3000 bp. Rekod sample Saiz Purata (bp) sebagai Saiz Perpustakaan.
    AWAS
    Bacaan kepekatan daripada Bioanalyzer (atau TapeStation) harus digunakan sebagai titik permulaan untuk membuat pencairan yang diperlukan atau pengumpulan perpustakaan untuk penjujukan. Sahkan kepekatan perpustakaan penjujukan akhir yang dicairkan atau kumpulan perpustakaan dengan kit Qubit dsDNA HS Assay (lihat Langkah 6).UNIVERSAL-SEQUENCING-TELL-Seq-Target-Enrichment-(23)Rajah 2. Seorang bekasample of exome captured library profile daripada ujian Pita Skrin Kepekaan Tinggi Stesen Pita D5000.
  3. Perpustakaan boleh disusun dengan segera atau disimpan pada -25°C hingga -15°C.
  4. Apabila penjujukan, cairkan perpustakaan menggunakan penimbal TE kepada kepekatan yang disyorkan oleh setiap sistem penjujukan Illumina®. Buat kumpulan perpustakaan yang dicairkan untuk penjujukan jika lebih daripada satu pustaka akan disusun dalam larian yang sama.
  5. Ukur kepekatan perpustakaan dengan Kit Ujian Qubit dsDNA HS. Gunakan nilai Saiz Purata daripada ukuran Bioanalyzer (atau TapeStation) sebagai saiz perpustakaan untuk penukaran kepekatan jisim kepada kepekatan molar (nM).

A = Kepekatan Jisim (ng/µL)
S = Saiz Perpustakaan (bp)
Kepekatan Molar (nM) = (A*1,000,000)/(S*650)
Laraskan kelantangan yang diperlukan dalam penyediaan penjujukan jika kepekatan perpustakaan yang diukur oleh Qubit berbeza daripada kepekatan yang disyorkan sebanyak lebih daripada 10%.

Dokumen / Sumber

JURUSAN SEMESTA TELL-Seq Pengayaan Sasaran [pdf] Panduan Pengguna
Pengayaan Sasaran TELL-Seq, TELL-Seq, Pengayaan Sasaran, Pengayaan

Rujukan

Catatan Berkaitan

Tinggalkan komen

Alamat e-mel anda tidak akan diterbitkan. Medan yang diperlukan ditanda *